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Potenciación de la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ADC de bajo ruido y alta velocidad

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La espectrometría de masas por tiempo de vuelo (TOF MS) se ha convertido en un instrumento fundamental para aplicaciones en muchos campos, especialmente por su papel insustituible en los laboratorios de microbiología clínica para la identificación bacteriana. En el corazón de la espectrometría de masas TOF MS se encuentra el convertidor analógico-digital (ADC) de alta velocidad y bajo ruido. En este artículo repasamos los fundamentos de la TOF MS centrándonos en sus parámetros clave.

En este artículo se analiza la relación entre los parámetros del TOF MS y las especificaciones del ADC. Los ADC de señal frontal mixta (MxFE®) demuestran que los ADC de bajo ruido y alta velocidad pueden mejorar en gran medida las métricas de la TOF MS, incluyendo la precisión de masa, la resolución de masa y la sensibilidad.

Introducción a TOF MS
La espectrometría de masas (EM) es una técnica analítica para cuantificar moléculas conocidas/desconocidas dentro de una muestra basándose en el peso molecular. Mediante la ionización de elementos y/o moléculas de la muestra en iones gaseosos con o sin fragmentación y su posterior separación en un analizador de masas, los elementos y/o moléculas se caracterizan por su relación masa-carga (m/z), o localización de los pulsos, y abundancia relativa, o las amplitudes de los pulsos, en los espectros de masas.
Un espectrómetro de masas consta de tres componentes principales: la fuente de iones para producir iones gaseosos a partir de la muestra sometida a prueba, el analizador de masas para separar los iones según sus relaciones m/z y el detector de iones para detectar los iones y la abundancia relativa de cada especie iónica. La salida del detector se acondiciona y digitaliza para producir un espectro de masas. Existen varios analizadores de masas con estrategias fundamentalmente diferentes para separar iones de distintos valores m/z.1 La figura 1 muestra los principales bloques de la EM cuádruple y la TOF.
En la TOF MS, los iones formados por un evento de ionización corto son acelerados por un campo electrostático de forma que los iones de diferentes m/z tienen la misma energía cinética pero diferentes velocidades. A continuación, los iones recorren una trayectoria de deriva sin campo y llegan al detector con diferentes tiempos de vuelo: los iones más ligeros llegan antes que los más pesados, como se ilustra en la figura 2. En la práctica, el tiempo de vuelo de un paquete de iones del mismo m/z se distribuye para formar un pulso que puede ser tan estrecho como unos cientos de picosegundos (ps) debido a las diferencias en las distribuciones espaciales iniciales y la energía (o velocidad) en la región de aceleración. Cada pulso es la suma de señales correspondientes a múltiples eventos independientes de llegada de iones y a menudo se caracteriza por el parámetro de anchura completa a la mitad máxima (FWHM).



Figura 1. Principales bloques de la EM cuádruple y TOF.



Figura 2: Ilustración de un analizador de masas por tiempo de vuelo.


Un detector, como un detector de placa de microcanal (MCP), detecta los iones entrantes y produce una corriente eléctrica de impulsos. La corriente eléctrica se registra con un convertidor tiempo-digital (TDC) o un ADC de alta velocidad. Aunque el TDC puede ser extremadamente rápido hasta unos pocos ps, tiene un rango dinámico limitado para registrar la amplitud de los pulsos. Los ADC de alta velocidad pueden alcanzar 2 o más gigamuestras por segundo (GSPS) con una resolución de bits de 10 bits, 12 bits o incluso superior, lo que permite un registro preciso tanto de la temporización como de la amplitud de los pulsos. Analizaremos especificaciones importantes de los ADC de alta velocidad que influyen en el rendimiento de la TOF MS.


Aplicaciones de TOF MS
La tecnología MALDI ioniza las moléculas de la matriz, normalmente ácidos orgánicos, y vaporiza las moléculas de la muestra al mismo tiempo con pulsos de láser ultravioleta (UV) de cientos de ps a unos pocos nanosegundos (ns). En la fase gaseosa, las moléculas de la matriz transfieren protones a las moléculas de la muestra, de modo que éstas se protonan y se convierten en iones cargados. Dado que la matriz absorbe la mayor parte de la energía láser, las moléculas de la muestra conservan su integridad sin fragmentarse ni descomponerse, lo que convierte al MALDI en el método de ionización más convincente para el análisis de macromoléculas biológicas. Gracias al fácil acoplamiento entre MALDI y TOF MS, el rango de masas ilimitado, la alta sensibilidad y el alto rendimiento, TOF MS se ha convertido en una herramienta esencial para la investigación biomédica, el descubrimiento de fármacos y las aplicaciones clínicas en las que los analitos suelen ser macromoléculas.

En particular, la EM MALDI TOF desempeña un papel insustituible en la identificación clínica de bacterias gracias a su tiempo de respuesta más rápido, de 4 horas, en comparación con las más de 72 horas de las tecnologías convencionales u otras nuevas.3 Un tiempo de respuesta corto es fundamental para la atención y el resultado de los pacientes que sufren infecciones bacterianas. Otras ventajas de MALDI TOF MS son la facilidad de preparación de las muestras, el bajo coste operativo y la posibilidad de identificar algunas bacterias poco comunes. Dado que la resistencia a los antimicrobianos supone una grave amenaza para la salud humana en todo el mundo, existe una tendencia a utilizar la MALDI TOF MS como dispositivo de punto de atención.4

Parámetros clave de TOF MS
La capacidad de la TOF MS para cuantificar los distintos analitos de las muestras de ensayo depende de muchos factores, como la elección del método de ionización de la muestra, la configuración y las características temporales de los campos eléctricos para acelerar y guiar los iones hacia el detector de iones, la eficiencia del detector y la digitalización de la señal. Limitaremos nuestra discusión a las especificaciones clave de la MS TOF que están relacionadas con la digitalización de la señal, incluyendo el rango de masas, la precisión de masa, la resolución de masa, la tasa de repetición y la sensibilidad.
El rango de masas es el rango del peso molecular de las moléculas de la muestra y está relacionado con varios factores, como el voltaje de aceleración, la longitud del tubo de vuelo, la frecuencia de muestreo y la frecuencia de repetición. Los requisitos del rango de masas varían según la aplicación. Por ejemplo, la identificación bacteriana por MALDI TOF MS mide marcadores ribosómicos en los rangos de masa de 2.000 Da a 20.000 Da.
Dado que la masa se calcula a partir del tiempo de vuelo, la precisión de masa de la TOF MS viene determinada principalmente por la precisión de la medición del tiempo de los pulsos. En la práctica, el tiempo de llegada de cada pulso se calcula ajustando el pulso a una función gaussiana y encontrando el pico. La frecuencia de muestreo del ADC determina el número de muestras para un pulso individual y es fundamental para ajustar el pulso.
La resolución de masa es una medida de la separación distinguible más cercana entre dos pulsos vecinos en el espectro. A menudo se define como la relación entre la masa del ion y la anchura del pulso de masa correspondiente. Una definición típica de la anchura de un pulso es la FWHM. Cuanto más estrecho es el pulso, mayor es la resolución de masa, lo que significa una mejor diferenciación entre dos paquetes de iones con pesos moleculares cercanos. Aunque la resolución de masa puede mejorarse significativamente mediante la aceleración ortogonal y el reflectrón, la frecuencia de muestreo del ADC y el rendimiento del ruido también afectan a esta especificación clave.
En la TOF MS, el espectro de masas es la suma de señales de muchas repeticiones en lugar de un único transitorio que incluye un único proceso de ionización, aceleración y deriva, y detección y digitalización de iones. Y lo que es más importante, para muestras de ensayo con múltiples moléculas de diferentes pesos moleculares y concentraciones, un único evento de ionización puede no producir iones de todas las moléculas de interés ni las proporciones proporcionales a su concentración. La suma es un método eficaz y práctico para reducir este error de muestreo y mejorar la relación señal-ruido (SNR). Por lo tanto, la tasa de repetición es una especificación importante y práctica de la TOF MS para la SNR y el rendimiento.
Los últimos TOF MS pueden lograr un barrido de 1 kHz o más rápido, lo que significa que cada transitorio dura 1 milisegundo (ms) o menos. El aumento de la frecuencia de muestreo del ADC acorta la duración de cada transitorio para una tasa de repleción más rápida.
La sensibilidad de la TOF MS es la capacidad de detectar las moléculas con menor concentración en las muestras. Está determinada colectivamente por muchos factores, como el ruido químico de fondo, el rango de concentraciones de todas las moléculas de interés, la figura de ruido y el rango dinámico del detector y el ADC, y el número de transitorios sumados para el espectro de masas final. En la práctica, la sensibilidad del sistema puede optimizarse identificando el factor de cuello de botella y/o equilibrando estos factores.

Especificaciones deseadas de los ADC para TOF MS
Un ADC de bajo ruido y alta velocidad es fundamental para el rendimiento del sistema de TOF MS. Como se ha comentado anteriormente, la precisión de la medición del tiempo y el nivel de ruido del sistema son dos especificaciones importantes del instrumento TOF MS. Aunque existe una solución para el nivel de ruido del sistema mediante la suma de mediciones repetitivas, la precisión de la medición del tiempo viene determinada por la frecuencia de muestreo y la fluctuación de apertura del ADC de alta velocidad. Teniendo en cuenta que los pulsos pueden ser tan estrechos como unos cientos de ps en un instrumento TOF MS con aceleración ortogonal y reflectrón, sólo hay unas pocas muestras para un pulso individual a una frecuencia de muestreo de 5 GSPS.
Cada muestra es crucial para encontrar el pico del pulso cuando las muestras se ajustan a una función gaussiana. De ahí que la frecuencia de muestreo y la fluctuación de apertura sean especificaciones deseables del ADC.
La sensibilidad viene determinada por el nivel de ruido del sistema, que puede mejorarse sumando las mediciones repetidas. Sin embargo, el número de repeticiones limita el rendimiento del instrumento. El rendimiento de ruido del ADC es importante para lograr la sensibilidad deseada con menos repeticiones. A menudo existe una percepción errónea sobre el rendimiento de los ADC, según la cual su SNR es proporcional a su resolución de bits. Los ADC con una frecuencia de muestreo de 1 GSPS o superior suelen utilizar la arquitectura de canalización y tienen especificaciones que incluyen un número efectivo de bits (ENOB) y densidad de ruido/cifra de ruido/SNR/etc. Sin embargo, los ADC en cadena no pueden alcanzar la resolución de bits, ya que presentan varios inconvenientes que contribuyen al ruido, como los amplificadores operacionales de alta ganancia y gran ancho de banda necesarios para reducir los errores, el desajuste de condensadores y la disipación de potencia de los amplificadores operacionales y de muestreo y retención (S/H) frontales.5 El ENOB depende de la frecuencia de entrada y de la velocidad de muestreo y se calcula con la relación señal/ruido y distorsión (SNDR). Por ejemplo, el AD9081 de 12 bits tiene un ENOB de 8 bits a 4 GSPS con una frecuencia de entrada de 4500 MHz. El ENOB no es una buena medida del rendimiento del ruido del ADC.
La densidad de ruido es un paso más hacia el nivel de ruido práctico, pero la prueba de banco con pulsos gaussianos mantiene la verdad básica del rendimiento de ruido del ADC y, por tanto, la sensibilidad del instrumento TOF MS.

Prueba en banco de un ADC de bajo ruido y alta velocidad
El MxFE ofrece una integración inteligente de ADC de RF, convertidores digital-analógico (DAC), procesamiento de señal digital en chip y bucle de reloj/fase bloqueada (PLL) para sincronización multichip. También hay disponibles piezas MxFE sólo con ADC de alta velocidad. Para simplificar, nuestra prueba de banco utilizó el AD9082, que tiene ADCs y DACs integrados, como se muestra en la Figura 3. El DAC integrado se utilizó para generar la señal de entrada. El DAC integrado se utilizó para generar un tren de pulsos gaussianos estrechos con un FWHM de 0,5 ns y amplitud controlada por una combinación de escalado digital y atenuadores externos. Los pulsos gaussianos son mucho más parecidos a la señal de los espectros de masas que la típica señal de un solo tono para la caracterización del ADC. Se configuran dos canales ADC para digitalizar la señal: CH1 para diversas amplitudes saturadas o atenuadas variando los atenuadores externos y CH2 como referencia para la intensidad de la señal por encima del 90% a escala completa (FS) sin saturación. La frecuencia de muestreo fue de 6 GSPS en nuestra prueba para obtener muestras suficientes para cada pulso.


Figura 3. Diagrama de bloques para la prueba del ADC de alta velocidad con el AD9082.

Se realizaron 3 tipos de pruebas:
u Pruebas de atenuación y saturación: CH2 con par de atenuadores fijos de 7 dB como referencia; CH1 con par de atenuadores de 8 dB, 9 dB y 10 dB para los casos de atenuación y par de atenuadores de 3 dB y 1 dB para los casos de saturación.
u Medida de señales débiles con hasta 20 dB de atenuación: CH2 conectado directamente a la salida DAC como referencia con escalado -16 dBFSC; CH1 con par de atenuadores de 10 dB para señal <32% FS y par de atenuadores de 20 dB para <10% FS.
u Medida de ruido: CH2 con par atenuador fijo de 7 dB como referencia; CH1 con terminación de 50 Ω.
Para cada prueba, adquirimos datos >10 µs y repetimos la adquisición de datos 10 veces para comprobar la reproducibilidad. Trazamos y analizamos los datos en MATLAB®. Las 10 repeticiones se alinearon y trazaron para cada caso de prueba. La figura 4 muestra un único pulso en la prueba en la que CH1 es 3 dB inferior a CH2. Las 10 repeticiones estaban bien superpuestas para ambos canales, lo que demuestra la alta reproducibilidad de la adquisición de datos.


Figura 4. La superposición de las 10 repeticiones demostró una alta reproducibilidad de la adquisición de datos.

El ADC AD9082 tiene un circuito de protección contra sobrecarga, que se activará si la amplitud de la entrada es superior al límite superior. A menudo se produce una cola de recuperación en la fase descendente del impulso si se activa el circuito de protección, lo que da como resultado un pico recortado en FS y una cola de recuperación.
Una cola de recuperación más corta es importante para una medición precisa del tiempo y, por tanto, de la masa para la TOF MS. La figura 5 muestra el gráfico de cinco casos con saturación (hasta 6 dB) o atenuación. Hubo una cola de recuperación de <0,4 ns para una saturación de 6 dB, lo que sugiere un ensanchamiento mínimo de la recuperación cuando se activó el circuito de protección.
Para probar el rendimiento del ADC con una entrada débil, adquirimos la señal atenuada en 10 dB y 20 dB, como se muestra en la figura 6. La traza limpia de la señal estaba al 10% de FS, o atenuada en 20 dB, lo que sugiere un ruido mínimo aportado por el ADC.
Para el ruido de fondo del ADC, CH1 se conectó con un terminador de 50 Ω, mientras que CH2 permanece en >90% FS, como se muestra en la Figura 7.
Analizamos los datos de ruido trazando el histograma y calculando su desviación estándar, como se muestra en la Figura 8. La desviación estándar de este caso se situó en 0,0025, lo que sugiere una SNR de 52 dB en FS.


Figura 5. La superposición de los 5 casos de prueba con saturación o sobre atenuación.



Figura 6. Casos de prueba con input atenuado por 10 dB y 20 dB.



Figura 7. Medida del ruido de fondo con CH1 conectado con terminador de 50 Ω.



Figura 8. Histogramas de la medición del ruido de fondo (CH1, izquierda) y de la señal FS (CH2, derecha)..

Para cuantificar aún más la precisión de la medición del tiempo y el rendimiento del ruido, segmentamos cada pulso con el pico en el centro de una ventana de 30 ns. A continuación, ajustamos cada pulso con un modelo gaussiano para medir su FWHM. Utilizamos datos de 12 ns a cada lado, o 24 ns en total, de la ventana de 30 ns como línea base para el cálculo del ruido.
La figura 9 muestra el gráfico de la adquisición completa para el caso de prueba de entrada al 10% de FS y zoom-in de un solo pulso con ajuste gaussiano y línea de base segmentada. La tabla 1 muestra la FWHM media y medida y la SNR calculada.


Figura 9. Segmentación de pulso y línea de base para la medición de FWHM y SNR para el caso de prueba de entrada al 10% de FS.


Tabla 1. Medida de FWHM y SNR para el caso de prueba de entrada al 10% de FS

Tabla 2. FWHM y SNR medidos


Discusión y conclusion
Con el establecimiento de la EM MALDI TOF como estándar para la identificación bacteriana en los laboratorios de microbiología clínica y el creciente interés en la proteómica para la medicina personalizada, se espera que la EM MALDI TOF continúe su impulso de crecimiento en la asistencia sanitaria en las próximas décadas. También existen amplias aplicaciones de la TOF MS en la investigación biomédica y el descubrimiento de fármacos, la seguridad alimentaria y la vigilancia medioambiental debido a su ventaja para moléculas intactas con una amplia gama de pesos moleculares. Con un rendimiento de ruido superior y una velocidad de muestreo de 3× a 6× más rápida que los ADC de la actual generación de instrumentos de MS TOF, el ADC de bajo ruido y alta velocidad es una parte crítica de la próxima generación de instrumentos de MS TOF de alto rendimiento. La alta velocidad de muestreo permite reducir la huella del instrumento TOF MS sin sacrificar el rendimiento, ya que puede reducir la longitud del tubo de vuelo y, por tanto, la carga del sistema de vacío. Una huella más pequeña es importante para las aplicaciones en el punto de atención y diversas aplicaciones de campo de TOF MS.

Existen limitaciones en nuestra prueba de banco del AD9082, incluyendo la disponibilidad limitada de atenuadores externos para crear casos de prueba con entrada de baja amplitud (como 1% FS, o 40 dB de atenuación), desajuste de impedancia que causa reflexión en los datos, y espacio abierto sin apantallamiento de interferencias electromagnéticas. La SNR notificada de los casos de prueba era inferior a su valor real porque la reflexión en la línea de base causada por el desajuste de la impedancia no se eliminaba en el cálculo del ruido. Placas de prueba MxFE junto con el software de interfaz gráfica de usuario (GUI) están disponibles para pruebas más intensivas. Unas instrucciones detalladas con ayuda de una demostración en directo pueden facilitar la configuración del sistema de evaluación del cliente. La creación de prototipos con muestras MxFE es fácil con la orientación de un equipo de aplicación experimentado.
La FWHM y la SNR medidas demuestran la superior precisión temporal y el rendimiento de ruido de los ADC MxFE. La frecuencia de muestreo de hasta 10 GSPS de MxFE disponible en el mercado ofrece la flexibilidad necesaria para diseñar MS TOF de nueva generación con mejor precisión y resolución de masas, mayor sensibilidad y un tamaño aún más reducido. Además, los ADC MxFE están respaldados por productos de alimentación, sincronización y controladores que ayudan a garantizar una integración y optimización perfectas de los sistemas.


Referencias
1 Jurgen H. Gross. Mass Spectrometry: A Textbook, 3rd Edition. Springer, 2017.
2 Eva Torres-Sangiao, Cristina Leal Rodriguez, and Carlos Garcia-Riestra. “Application and Perspectives of MALDI–TOF Mass Spectrometry in Clinical Microbiology Laboratories.” Microorganisms, Vol. 9, 2021.
3 Mohammad Y. Ashfaq, Dana A. Da’na, and Mohammad A. Al-Ghouti. “Application of MALDI-TOF MS for Identification of Environmental Bacteria: A Review.” Journal of Environmental Management, Vol. 305, 2022.
4 E. Chabriere, H. Bassène, M. Drancourt, and C. Sokhna. “MALDI-TOF MS and Point of Care Are Disruptive Diagnostic Tools in Africa.” New Microbe and New Infections, Vol. 26, 2018.
5 Chun C. Lee. Dissertation: Improving Accuracy and Energy Efficiency of Pipeline Analog to Digital Converters. The University of Michigan, 2010.
Sobre el autor
Guixue (Glen) Bu es ingeniero de diseño/arquitectura de sistemas en el Instrumentation System Solutions Group con enfoque de I+D en desarrollo y aplicaciones de instrumentación científica. Se unió a Analog Devices en septiembre de 2018. Obtuvo su licenciatura en ingeniería en la Universidad de Tsinghua y su maestría y doctorado en la Universidad de Purdue, todos en ingeniería biomédica.

Autor: Guixue (Glen) Bu, Systems Design Engineer en ADI

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